在之前的两期文章中，我们讨论了细胞转染与慢病毒转染的基本概念。这一期，我们将着重讲解慢病毒转染的实验步骤、注意事项及常见问题。

一、慢病毒实验步骤

慢病毒实验的主要流程包括质粒构建、病毒包装、病毒收集与浓缩、感染靶细胞，以及筛选与验证五个步骤。

1. 质粒构建

通过将外源性目的基因片段插入质粒载体，构建重组质粒。在大肠杆菌中转化后，提取得到重组质粒DNA。

2. 病毒包装

将重组质粒DNA与其它包装质粒按说明书的比例共同转染293T细胞，经过48小时和72小时分别收获包含病毒的上清液。

3. 病毒收集与浓缩

将收集的含病毒上清以3000rpm离心20分钟，再通过045um滤膜过滤以去除细胞沉淀。接着，将上清继续以12000rpm离心进行初步浓缩，并分装在-80°C储存。必要时可进行目的基因的滴度测定。超速离心法和PEG沉淀法均可高效浓缩病毒，但超速离心设备要求较高；而PEG沉淀法操作简单、成本低但效率略低。

4. 慢病毒转染细胞

在转染的第一天，以293T细胞为例，消化并计数后调节细胞密度至1x10⁵个/mL，接种到24孔板中，每孔加0.5mL，放在37°C, 5% CO₂环境下培养。应确保在感染时细胞汇合度在30%-50%。

第二天，观察细胞生长情况，吸去旧培养基，加入预热的新鲜完全培养液，每孔0.25mL，再次放入37°C, 5% CO₂培养箱培养4小时。此外，应设定不加病毒的对照组。

在转染后的第三天，观察细胞状态是否正常，若无异常，吸去含病毒的培养液，更换新鲜的完全培养液继续培养。

在第四到第六天，观察转染效果。若转染了带荧光基团的慢病毒，可在转染后的48小时通过倒置荧光显微镜检测荧光强度，初步评估转染效果。同时可以添加适宜浓度的puromycin或其它筛选药物，以筛选成功转染的细胞。对于生长缓慢的细胞，可以观察时间延长至96小时。

二、慢病毒实验注意事项

(1) 病毒的保存：适当保存病毒，短期可在4°C冰箱储存（不超过一周），长期分装后应在-80°C冷冻保存不超过6个月。使用时应避免反复冻融以保护病毒活性。

(2) 细胞状态：选择生长在对数期的细胞进行转染，以提高转染效率。

(3) 细胞接种量：根据增殖速度与培养器皿的大小调整接种量，确保细胞在感染前的密度保持在30%-50%之间。

(4) MOI值：通常MOI值越高，转染的难度越大，应提前计算细胞接种量以优化转染效率。

(5) 文献查找：在实验前查阅相关文献，确保了解靶细胞的培养条件与生长特性，以优化转染条件。

(6) 细胞状态观察：转染前后需仔细观察细胞状态，若细胞状态不佳，先调整状态再进行药物筛选。

(7) 观察时间：一般在转染后的48-72小时进行观察，有些增殖缓慢的细胞可延长至96小时。

三、实验常见问题

Q1: 如何提高慢病毒对细胞的感染效率？
要提高感染效率，需保证细胞状态良好、密度合适以及合适的感染条件。对悬浮细胞，建议采用离心感染法。

Q2: 转染后细胞死亡该怎么办？
与感染效率相关的因素相近，调整细胞状态和感染条件通常能改善情况。

Q3: 稳定转染目的基因会整合到染色体吗？瞬时转染是否会？
稳转使用的质粒含有抗性基因，通过药物筛选成功转入的细胞，而瞬时转染因无药物压力，阳性细胞数目逐渐减少。

Q4: 慢病毒转染时，细胞接种量应是多少？
根据细胞增殖速度与培养容器大小调节，以保证在感染后4天左右细胞能达到接近融合状态。

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